Vào năm 1883, Ehrlich đã mô tả phương pháp xác định bilirubin trong nước tiểu bằng phản ứng của bilirubin với acid diazosulfanilic tạo ra một phức hợp màu. Kể từ đó trở đi, phương pháp này trở thành nền tảng và ứng dụng cho đến ngày nay, dưới cái tên “phản ứng diazo”. Vào năm 1919, van den Bergh đã phát hiện ra phản ứng diazo có thể sử dụng để xác định bilirubin trong huyết thanh nhưng cần tới sự có mặt của chất xúc tác (accelerator). Tuy nhiên, phương pháp còn gặp nhiều lỗi gây ra bởi chất xúc tác. Cho đến năm 1937, Malloy và Evelyn đã phát triển phương pháp định lượng bilirubin đầu tiên trong huyết thanh dựa trên phản ứng diazo với chất xúc tác là dung dịch methanol 50%. Trong năm 1938, Jendrassik và Grof đã mô tả phương pháp sử dụng phản ứng diazo với chất xúc tác là caffeine-benzoate-acetate. Ngày nay, hầu hết các phương pháp định lượng bilirubin trong huyết thanh đều ứng dụng kỹ thuật mô tả bởi Malloy và Evelyn.

Bilirubin cũng có thể được xác định bằng máy đo bilirubin (bilirubinmeter) ở trẻ sơ sinh. Phương pháp này chỉ sử dụng cho trẻ sơ sinh mà không dùng cho người lớn, bởi vì thành phần carotinoid trong huyết thanh của người lớn sẽ gây nhiễu kết quả khi đo. Nguyên lý của phương pháp là dựa vào sự phản xạ ánh sáng từ da khi chiếu vào hai bước sóng. Các thế hệ máy đo bilirubin mới hiện nay sử dụng công nghệ vi quang kế (microspectrophotometer), có thể xác định bilirubin, hemoglobin và melanin trên da của trẻ sơ sinh, dựa vào xác định mật độ quang học trên da.

Phản ứng diazo có thể xác định được hai trong ba loại bilirubin. Bilirubin không liên hợp có đặc điểm không tan trong nước, được gắn với albumin trong huyết thanh, do đó nó sẽ không phản ứng trực tiếp với acid diazosulfanilic (thuốc thử diazo) mà cần có thêm chất xúc tác (có tính hòa tan) thì mới xảy ra phản ứng. Vì vậy, song song với cách gọi “bilirubin không liên hợp” thì có thể gọi là “bilirubin gián tiếp”, bilirubin phản ứng gián tiếp với thuốc thử diazo. Bilirubin liên hợp có đặc điểm tan trong nước, trong huyết thanh nó không gắn với bất kỳ protein nào, bởi vậy nó có thể phản ứng trực tiếp với acid sulfanilic (thuốc thử diazo) mà không cần tới sự có mặt của chất xúc tác. Do đó, bilirubin liên hợp còn có cách gọi khác là “bilirubin trực tiếp”. Ngày nay, cách gọi cũ “bilirubin trực tiếp, bilirubin gián tiếp” vẫn được sử dụng cùng với cách gọi mới “bilirubin liên hợp, bilirubin không liên hợp” với ý nghĩa tương đương nhau. Tuy nhiên, cần đồng bộ cách gọi, tránh trường hợp sử dụng “bilirubin trực tiếp, bilirubin không liên hợp” hoặc “bilirubin liên hợp, bilirubin gián tiếp”.

Một loại bilirubin thứ ba ít được đề cập tới là delta bilirubinDelta bilirubin là một loại bilirubin liên hợp nhưng chúng lại gắn với albumin. Loại bilirubin này chỉ tìm thấy ở bệnh nhân tắc nghẽn gan (hepatic obstruction). Bình thường, chỉ bilirubin không liên hợp mới gắn với albumin, còn bilirubin liên hợp thì không. Khi vận chuyển tới gan, bilirubin không liên hợp sẽ tách khỏi albumin và kết hợp với acid glucuronic dưới tác dụng của enzyme uridyldiphosphate glucuronyl transferase (UDPGT) trong tế bào gan, để trở thành bilirubin liên hợp. Tuy nhiên trong trường hợp tắc nghẽn đường mật trong gan kéo dài gây ứ mật, đặc biệt là kèm với suy thận, các bilirubin liên hợp có thể gắn với albumin mà không cần xúc tác của enzyme tạo thành phức hợp biliprotein, hay delta bilirubin. Như vậy tình trạng ứ mật trong gan sẽ làm tăng thành phần delta bilirubin. Cũng giống như bilirubin không liên hợp, delta bilirubin không qua được màng lọc cầu thận do gắn với albumin và nửa đời sống của delta bilirubin là 14 ngày (cùng với thời gian bán hủy của albumin). Delta bilirubin cũng phản ứng giống như bilirubin liên hợp, tức là phản ứng trực tiếp với thuốc thử diazo. Bởi vậy, bilirubin toàn phần sẽ gồm ba loại: bilirubin liên hợp, bilirubin không liên hợp và delta bilirubin.

Tác giả: Lê Văn Công – Chuyên viên quản lý sản phẩm Phương Đông

Tài liệu tham khảo: Phân tích các xét nghiệm hóa sinh lâm sàng 2020 – Lê Văn Công